外泌体探索之旅：揭秘分离鉴定技术
利用外泌体发挥临床疾病诊断和载药治疗等多方面的应用研究持续深入，但由于外泌体纳米级别的大小和异质性以及体液复杂的组成，使得体液来源外泌体的分离尤为困难，充分了解外泌体的分离鉴定方法，有利于促进外泌体分离技术的进步，推动外泌体的临床应用。
外泌体的分离
目前，最常用的外泌体a分离方法是超速离心法(UC)、密度梯度离心法、超滤法(UF)、排粒径色谱法(SEC)、亲和捕获法和聚合物沉淀法。
▶超速离心法
通过外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等分离出去，从而得到纯净的外泌体。该方法简单，提取过程中不会引入其他的标记物，纯度较高，但需要大型设备、耗时长，易破坏外泌体完整性。
▶密度梯度离心法
该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，利用外泌体1.13g/mL-1.21g/mL的密度范围，实现外泌体与非囊泡颗粒(如蛋白质、蛋白质/RNA聚集体等)进行分离，从而能够提取含量低的外泌体。
外泌体的分离方法[1]
▶超滤法
通过外在施加压力在超滤膜两边形成压力差来实现分离。该方法简单、快速、适合大量样品的分离，但易堵塞、需要配套压力设备。
▶排粒径色谱法
根据尺寸大小分离溶液中颗粒，纯度高、外泌体完整、活性高、操作简单，但需要特殊设备，处理样品量小。
▶亲和捕获法
采用与外泌体高亲和力的材料对外泌体进行可逆结合洗脱纯度高，外泌体形态完整，但效率低，生物活性易受影响。
▶聚合物沉淀法
聚乙二醇(PEG)可竞争性结合游离水分子，从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出，简单、快速、产量高，不需要特殊设备，但是提取的外泌体纯度有待提升。
建立一套从外泌体提取到临床应用的完整解决方案，以满足外泌体质量的试验需求，是推动外泌体大规模临床应用所迫切需要的。
外泌体的鉴定
分离富集之后，我们又该如何鉴定提取出来的物质是外泌体呢？根据国际细胞外囊泡研究协会(ISEV)针对囊泡研究提出的MISEV 2018指南(定义细胞外囊泡及功能的最低实验要求)，细胞外囊泡(EVs，含外泌体)鉴定主要分为总体表征和个体表征两部分。
▶总体表征（外泌体蛋白分析）
建议用Western Blot或流式细胞术对阳性标志物和阴性标志物进行表征，要求至少检测三类蛋白(两阳一阴)：1个跨膜蛋白和1个细胞溶质蛋白、1个阴性蛋白质标志物，以证明其特征。
●跨膜或GPI锚定蛋白：证明与质膜和/或内体相关，常用的有四次穿膜蛋白家族的CD63、CD9、CD81等。
●被囊括进去的胞质蛋白：如肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白-70(HSP70)、调亡诱导因子6相互作用蛋白(ALIX)等。
●存在于其他胞内细胞器的阴性蛋白：如核蛋白Histone、LaminA，内质网蛋白calnexin，高尔基体蛋白GM130，线粒体蛋白cytochromec，以及细胞骨架蛋白cytokeratin18等。
外泌体的标记物[2]
▶个体表征（外泌体形态和粒径分析）
●形态分析：应用透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)方法对外泌体的形态及粒径进行表征。TEM被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法，TEM视野下，外泌体呈圆形或杯状结构。
●粒径分析：应用动态光散射(DLS)或纳米颗粒跟踪分析(NTA)方法，对粒径分布进行分析。纳米颗粒跟踪分析(NTA)是一种广泛用于确定外泌体浓度和尺寸分布的方法，外泌体的粒径分布区间在40-150nm。
外泌体形态和粒径分布分析[3]
经过了蛋白维度、形态维度以及粒径分布维度三个层面的表征，基本可以确认分离出的组分为外泌体。
参考文献：
[1]Yu LL, Zhu J, Liu JX, Jiang F, Ni WK, Qu LS, Ni RZ, Lu CH, Xiao MB. A Comparison of Traditional and Novel Methods for the Separation of Exosomes from Human Samples. Biomed Res Int. 2018 Jul 26;2018:3634563.
[2]Hade MD, Suire CN, Suo Z. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes: Applications in Regenerative Medicine. Cells. 2021 Aug 1;10(8):1959.
[3]Li X, Wang W, Chen J, et al. The potential role of exosomal miRNAs and membrane proteins in acute HIV-infected people. Front Immunol. 2022:13:939504.